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　　天然糖類是活性天然產(chǎn)物的一個(gè)重要結(jié)構(gòu)單元，糖苷化修飾有利于提高活性分子的生物相容性及靶點(diǎn)識(shí)別的特異性，迄今許多臨床一線使用的藥物如紅霉素、阿霉素及萬(wàn)古霉素等都是糖苷類化合物。弩箭子糖(antiarose)是一類六碳脫氧糖，最初于1896年由水解劇毒木本植物見(jiàn)血封喉樹(shù)汁液中的天然毒素—— α-弩箭子甙(α-antiarin)得到。據(jù)報(bào)道，目前大約有50多種強(qiáng)心苷類化合物中含有弩箭子糖結(jié)構(gòu)，這一類強(qiáng)心苷類化合物對(duì)Na⁺/K⁺-腺苷三磷酸酶或者是人腫瘤細(xì)胞系具有納摩爾級(jí)的抑制活性，它們?cè)谛牧λソ?、房性心律失常和癌癥的治療方面具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。除上述強(qiáng)心苷外，弩箭子糖這一不常見(jiàn)的天然結(jié)構(gòu)僅存在于少數(shù)幾個(gè)天然產(chǎn)物中，且目前弩箭子糖的生物合成機(jī)制尚不清楚。 

　　2016年初，中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所天然藥物化學(xué)前沿交叉團(tuán)隊(duì)黃勝雄研究組闡明了托酚酮吡啶生物堿類化合物rubrolones生物合成過(guò)程涉及二型聚酮合酶和氧化酶介導(dǎo)的復(fù)雜氧化重排形成托酚酮環(huán)的化學(xué)機(jī)制(Org. Lett. 2016, 18, 1254)。隨后通過(guò)該研究組對(duì)rubrolones的生物合成途徑作了進(jìn)一步地詳細(xì)解析，闡明了自然界普遍存在非酶催化的吡啶環(huán)生物合成機(jī)制 (Nat. Commun. 2016, 7, 13083)。 

　　最近，該課題組在前期生物合成解析基礎(chǔ)上，對(duì)其糖配體的關(guān)鍵基因進(jìn)行了深入研究。通過(guò)系列的體外酶學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了rubrolones中糖配體關(guān)鍵基因RubS3-S5的作用邏輯，并運(yùn)用波譜學(xué)方法確定了酶RubS3作用后的產(chǎn)物為TDP-D-antiarose (4)。分析酶RubS3體外反應(yīng)的底物TDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose (1)和產(chǎn)物TDP-D-antiarose (4)的結(jié)構(gòu)差異，對(duì)酶RubS3可能的催化機(jī)制提出了三種假設(shè) (圖1, 機(jī)制 A、B和C)。隨后，通過(guò)設(shè)計(jì)系列氘原子標(biāo)記的體外酶學(xué)實(shí)驗(yàn)探索了酶RubS3的作用機(jī)理，初步發(fā)現(xiàn)它通過(guò)推測(cè)的機(jī)理C產(chǎn)生作用，即NADPH中4S-H傳遞到C-4位羰基，完成羰基的還原，溶劑中的質(zhì)子傳遞到C-3位，經(jīng)烯醇中間體完成C-3位的異構(gòu)，從而形成產(chǎn)物TDP-D-antiarose (4)。酶RubS3由此被鑒定為一類新型的還原-異構(gòu)雙功能酶，系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)rubterolone生物合成基因簇中的酶RblE與之有較高的相似性。后續(xù)的體外酶學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)酶RblE也能將底物TDP-4-keto-6-deoxy-D-glucose轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物TDP-D-antiarose，且與酶RubS3具有相似的米氏動(dòng)力學(xué)參數(shù)。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)酶RubS3具有短鏈脫氫/還原酶中的活性催化三聯(lián)體Thr111-Tyr135-Lys139。據(jù)此，使用點(diǎn)突變的方法構(gòu)建了酶RubS3的三種突變蛋白(T111V, Y135F和 K139A)，體外酶學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)上述突變蛋白的催化活性較野生型蛋白顯著降低或完全消失，但有關(guān)酶RubS3堿性殘基的突變的一系列蛋白突變體卻沒(méi)有表現(xiàn)出催化能力的改變，暗示酶RubS3作用時(shí)C-3位羥基的異構(gòu)可能經(jīng)由一種潛在的新機(jī)制完成。 

　　上述研究?jī)?nèi)容表明，RubS3和RblE是一類新型的還原-異構(gòu)雙功能酶，它們均通過(guò)圖2所示的機(jī)制催化自然界中稀有弩箭子糖的生物合成。這一類酶的發(fā)現(xiàn)解決了百年來(lái)懸而未決的有關(guān)自然界中弩箭子糖如何形成的科學(xué)問(wèn)題，為后期利用相關(guān)組合生物合成和合成生物學(xué)手段擴(kuò)充天然糖苷化合物的結(jié)構(gòu)多樣性奠定了基礎(chǔ)。 

　　該研究成果以“Biosynthetic access to the rare antiarose sugar via an unusual reductase-epimerase”為題在線發(fā)表于國(guó)際期刊Chemical Science。上述研究工作得到了國(guó)家自然科學(xué)基金-云南省聯(lián)合基金重點(diǎn)項(xiàng)目(U1702285)、國(guó)家合成生物學(xué)重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、中科院青年創(chuàng)新促進(jìn)會(huì)專項(xiàng)、云南省人才專項(xiàng)和應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃等項(xiàng)目資助。 

　　文章鏈接 

圖1. 酶RubS3將底物1轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物4的三種可能機(jī)制 

圖2. 酶RubS3可能的催化機(jī)制