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　　Oxepinone環(huán)在天然產物的骨架結構中頗為獨特。盡管已有研究表明GilOII加氧酶能夠產生含oxepinone的中間體，但隨即發(fā)生中間體開環(huán)脫羧的連續(xù)催化導致酶產物并不具有oxepinone骨架。因此，特異形成oxepinone產物的酶尚待發(fā)掘。高等真菌褐蓋韌革菌 (Boreostereum vibrans) 發(fā)酵液不僅富含混源萜類次生代謝產物韌革菌素 (vibralactone，1)，還能夠顯著積累含oxepinone骨架結構的產物1,5-seco-vibralactone (3)。中國科學院昆明植物研究所植物化學與西部植物資源持續(xù)利用國家重點實驗室曾英專題組，圍繞韌革菌素的生物合成開展研究工作，2013年以來相繼揭示了韌革菌素的融合雙環(huán)內酯骨架來源于對羥基苯甲酸 (Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 2298-2302; DOI: 10.1002/anie.201208182)，經由中間體6發(fā)生芳環(huán)加氧擴環(huán)反應形成產物3的oxepinone骨架 (Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 5463-5466; DOI: 10.1002 /anie.201510928)，后續(xù)由環(huán)合酶VibC催化oxepinone單元發(fā)生分子內環(huán)合反應生成韌革菌素 (Angew. Chem. Int. Ed. 2020, 59, 7209-7213; DOI: 10.1002/anie.202000710)。然而，對羥基苯甲酸 (2) 如何轉化為含oxepinone的產物3，包括相應的催化酶及反應中間體仍屬未知。 

　　在此次研究中，曾英專題組研究人員首先采用酶活性導向分離和蛋白質組分析技術手段，從褐蓋韌革菌菌絲總蛋白提取物中分離鑒定了催化6加氧擴環(huán)形成oxepinone產物3的黃素單加氧酶VibO，證明其黃素輔因子為FAD，且嚴格依賴NADPH；確定了VibO酶反應副產物7的化學結構，很顯然7來自6的鄰位羥化，但褐蓋韌革菌發(fā)酵液中并未檢測到7的存在。研究發(fā)現(xiàn)，隨著NADPH濃度增加，3的產量達到高點后迅速下降，而羥化產物7的積累則持續(xù)攀升；VibO不能將7轉化為3，更不能促使3變成7。由此可見，氧化6生成3和7的路徑不同，VibO不可能采取羥化路徑形成產物3的oxepinone環(huán)。通過同位素標記和NMR分析酶產物，研究人員進一步確定了加入分子氧及交換氫的位置。 

　　隨后，曾英專題組與上海有機化學研究所潘李鋒課題組開展合作，解析了VibO的晶體結構、活性部位、以及催化機理。盡管VibO在結構上與催化苯酚發(fā)生鄰位羥化反應生成兒茶酚的羥化酶相近，但結構分析及生化研究結果支持VibO采取Baeyer-Villiger氧化形成oxepinone環(huán)。光譜分析發(fā)現(xiàn)，VibO在不添加底物6時仍然消耗NADPH，反應速度及消耗量幾乎等同于存在6的酶反應；靜態(tài)及動態(tài)光譜特征表明黃素中間體為FAD-C4a-OO(H)。此外，研究人員還鑒定了催化對羥基苯甲酸 (2) 生成4的膜結合型異戊烯基轉移酶VibP1/VibP2，以及將中間體4分步還原為6的羧酸還原酶BvCAR和醛還原酶BvAR1/BvAR2/BvAR3。至此，研究人員徹底闡明了韌革菌素生物合成的酶分子機制，并采用一鍋法從對羥基苯甲酸成功合成3和1，同時還利用大腸桿菌實現(xiàn)了韌革菌素的異源合成。 

　　該研究成果以A flavin-monooxygenase catalyzing oxepinone formation and the complete biosynthesis of vibralactone為題，在線發(fā)表于Nature Communications。曾英專題組的博士后馮克娜和博士研究生張悅，以及上海有機化學研究所博士研究生張明芳為本文共同第一作者，曾英研究員和上海有機化學研究所潘李鋒研究員為本文的共同通訊作者。這項工作得到國家合成生物學重點研發(fā)計劃、國家自然科學基金等項目資助。

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